ISO10993亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)報(bào)告由上海飛凡檢測研究中心權(quán)威提供！上海飛凡檢測，國家認(rèn)可一站式檢測服務(wù)機(jī)構(gòu)，24小時免費(fèi)服務(wù)熱線：4007726386手機(jī)13764818040（黃工） 1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了嚙齒類動物亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于檢測化學(xué)品的亞慢性經(jīng)口毒性。 2 規(guī)范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (NO. 408, November 1998) USEPA OPPTES Health Effects Test Guidelines (Series 870.3150 June 1996) 3 試驗(yàn)?zāi)康?確定一定時期內(nèi)經(jīng)口反復(fù)接觸受試化學(xué)物引起的毒性效應(yīng)，了解受試樣品毒作用的靶器官，取得受試樣品亞慢性經(jīng)口的大無作用劑量，為確定慢性毒性試驗(yàn)的劑量和初步計(jì)算人群接觸的安全水平提供依據(jù)。 4 定義 4.1 亞慢性經(jīng)口毒性（Subchronic Oral Toxicity）：是指實(shí)驗(yàn)動物在其部分生存期（不超過10%壽命期）內(nèi)，每日反復(fù)經(jīng)口接觸受試樣品后所引起的健康損害效應(yīng)。 4.2無可見有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，用現(xiàn)有的技術(shù)手段或檢測指標(biāo)未觀察到任何與受試樣品有關(guān)的毒性作用的大染毒劑量。 4.3低可見有害作用水平（Lowest Observed Adverse Effect Level，LOAEL）：在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，受試樣品引起實(shí)驗(yàn)動物形態(tài)、功能、生長發(fā)育等發(fā)生有害改變的低染毒劑量。 4.4 靶器官(Target Organ)：實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)由受試樣品引起的明顯毒性作用的任何器官。 5 試驗(yàn)基本原則 各組實(shí)驗(yàn)動物每日經(jīng)口攝入不同劑量的受試樣品，連續(xù)染毒3個月（90d），有時候可根據(jù)需要染毒6個月（180d），染毒期間每日觀察動物的毒性反應(yīng)。在染毒期間死亡的動物要進(jìn)行尸檢。染毒結(jié)束后所有存活的動物均要處死、剖驗(yàn)以及作適當(dāng)?shù)牟±斫M織學(xué)檢查。 6 試驗(yàn)方法 6.1 受試樣品 在開始本試驗(yàn)之前，應(yīng)盡量搜集受試樣品現(xiàn)有的各種資料。 6.1.1 受試樣品的商品名和其他名稱（包括CAS號）。 6.1.2 受試樣品的結(jié)構(gòu)式、分子式和分子量。 6.1.3 受試樣品的理化性質(zhì)(可包括：外觀、沸點(diǎn)、熔點(diǎn)、折射率、密度、光譜資料、溶解度、揮發(fā)性、化學(xué)活性、光化學(xué)性質(zhì)、電離度、粒度、密度等)。重要的參數(shù)還包括穩(wěn)定性（包括在賦形劑或飼料中）。 6.1.4 受試樣品的分析方法。 6.1.5 受試樣品的生產(chǎn)方法、合成路線和雜質(zhì)。 6.1.6 儲存方法 要有長期儲存受試樣品（包括在賦形劑或飼料中）的合適方法。否則需定期制備新鮮樣品。 6.1.7 人類每日可能接觸的水平 6.1.8 接受樣品的日期應(yīng)登記。開始試驗(yàn)前應(yīng)有適當(dāng)數(shù)量的受試樣品。樣品來源和批號應(yīng)相同，盡可能使用同一批生產(chǎn)的受試樣品，否則，每一批受試樣品的純度和雜質(zhì)要分別測定。 6.2 實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境 6.2.1實(shí)驗(yàn)動物 常規(guī)選擇嚙齒類動物，可以選擇]大鼠。動物斷奶后盡早進(jìn)行試驗(yàn)，盡量使動物在其體重快速增長期有更長的時間接觸受試樣品。大鼠6周齡好，不可超過8周齡（體重80～120g，但動物體重的變動范圍按性別不應(yīng)超出平均體重的20%）。染毒開始前至少要有5d時間使實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)清潔級動物房飼養(yǎng)環(huán)境，并在這段時間內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)動物的狀態(tài)。 6.2.2 環(huán)境設(shè)施 實(shí)驗(yàn)動物和動物試驗(yàn)的環(huán)境設(shè)施應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。動物可分性別群飼或單籠飼養(yǎng)，群飼時每籠不超過5只。 6.2.3 動物的性別和數(shù)量 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分組，每組至少20只，雌雄各半。但是考慮到亞慢性試驗(yàn)的重要性，應(yīng)適當(dāng)增加每組雌雄動物數(shù)。若計(jì)劃在試驗(yàn)過程中處死動物，需增加計(jì)劃處死的動物數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束時的動物數(shù)需達(dá)到能夠有效評價受試樣品毒性作用的數(shù)量。 6.3 劑量設(shè)計(jì) 試驗(yàn)一般設(shè)三個染毒組和一個對照組。對照組動物不接觸受試樣品，其它條件均與染毒組相同。高染毒劑量應(yīng)使動物產(chǎn)生較明顯的毒性效應(yīng),但不引起過多動物死亡(死亡率不應(yīng)超過10%)，以免影響結(jié)果評價。低劑量組應(yīng)不出現(xiàn)任何毒性作用。若掌握人群接觸水平，則低染毒劑量應(yīng)高于人群的實(shí)際接觸水平。如劑量設(shè)計(jì)得當(dāng)，中劑量組可出現(xiàn)較輕的毒性效應(yīng)，若設(shè)多個中劑量組時，應(yīng)產(chǎn)生不同程度的毒性效應(yīng)。此外，可另設(shè)一附加組作追蹤觀察，選用20只動物(雌雄各半)，給予高劑量受試樣品，染毒90d，在全程染毒結(jié)束后繼續(xù)觀察一段時間(一般不少于28d)，以了解毒性作用的持續(xù)性、可逆性或遲發(fā)毒作用；也可在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時每組增加一定的動物數(shù)，試驗(yàn)結(jié)束時每組剖殺部分動物（數(shù)量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)分析），部分動物繼續(xù)作追蹤觀察。 若為染毒目的加入其它溶劑等賦形劑，這些賦形劑不應(yīng)影響受試樣品的吸收或引起毒性作用，必要時應(yīng)設(shè)相應(yīng)的賦形劑對照組。 如果受試樣品的毒性較低，則加入飼料的受試樣品比例較大，應(yīng)注意混入飼料中的受試樣品不應(yīng)超過5%，否則會對動物正常營養(yǎng)產(chǎn)生影響。必要時應(yīng)定期監(jiān)測飼料或飲水中的受試樣品濃度，觀察其均勻性和穩(wěn)定性。若采用灌胃方式染毒，則每日染毒時點(diǎn)應(yīng)相同，并定期 (每周)按體重調(diào)整灌胃量，維持染毒劑量不變。其它的染毒方式要加以特殊說明。 6.4 染毒方法 常用的方法是將受試樣品混入飼料或飲水中，每周7d染毒。若受試樣品引起飼料和飲水的適口性不良，影響動物正常攝入量，或由于某種原因，受試樣品不能加入飼料和飲水中，可采用灌胃法或藥囊法，此時每周可染毒5～7d。試驗(yàn)期間各組動物染毒的方式應(yīng)完全相同。 6.5 限量試驗(yàn) 在試驗(yàn)中，如果劑量預(yù)期達(dá)每天1000 mg/kg或以上時仍未產(chǎn)生可觀測到的毒性效應(yīng)（但人類接觸水平的資料表明需用高劑量進(jìn)行試驗(yàn)），而且根據(jù)相關(guān)結(jié)構(gòu)化合物可以預(yù)測受試樣品毒性時，可不必設(shè)三個劑量水平進(jìn)行試驗(yàn)。 6.6 臨床觀察 試驗(yàn)期內(nèi)每天至少觀察一次，必要時增加觀察次數(shù)。對附加組還要增加至少28d。 觀察期間對動物的任何毒性表現(xiàn)均應(yīng)記錄，記錄內(nèi)容包括發(fā)生時間、程度和持續(xù)時間。觀察應(yīng)至少包括如下內(nèi)容：皮膚和被毛、眼和粘膜、呼吸、循環(huán)、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體運(yùn)動和行為活動等改變。對死亡動物應(yīng)進(jìn)行解剖，對質(zhì)弱或?yàn)l死動物應(yīng)隔離或處死和解剖。記錄每周飼料消耗量，經(jīng)飲水染毒時還應(yīng)記錄每天飲水消耗量，記錄每周體重變化。試驗(yàn)結(jié)束時處死動物作相關(guān)檢查。 6.7 臨床檢查 6.7.1 眼科檢查 建議在動物染毒前和染毒后，好對所有實(shí)驗(yàn)動物，至少應(yīng)對高劑量組和對照組動物，使用眼科鏡或其它有關(guān)設(shè)備進(jìn)行眼科檢查。若發(fā)現(xiàn)動物有眼科變化則應(yīng)對所有動物進(jìn)行檢查。 6.7.2 血常規(guī)檢查和其它血液指標(biāo)檢查 至少應(yīng)在染毒結(jié)束時進(jìn)行，必要時應(yīng)在染毒中期也進(jìn)行檢查。如設(shè)立附加組，染毒結(jié)束時如有異常的指標(biāo)，附加組追蹤觀察結(jié)束時應(yīng)進(jìn)行檢查。測定指標(biāo)至少應(yīng)包括血球壓積、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)和分類，必要時測定網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、凝血功能等指標(biāo)。 6.7.3 血液生化檢查 至少應(yīng)在染毒結(jié)束時進(jìn)行，必要時應(yīng)在染毒中期也進(jìn)行檢查。染毒結(jié)束時如有異常的指標(biāo)，附加組追蹤觀察結(jié)束時應(yīng)進(jìn)行檢查。檢查指標(biāo)包括肝功能、腎功能、電解質(zhì)平衡、碳水化合物代謝等。測定指標(biāo)至少應(yīng)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）、總蛋白(TP)等，還應(yīng)根據(jù)受試樣品可能的毒作用表現(xiàn)補(bǔ)充如下指標(biāo)：如鳥氨酸脫羧酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、總膽固醇、甘油三酯、正鐵血紅蛋白、膽堿酯酶、鈣、磷、氯、鈉、鉀、血糖等。此外，還可根據(jù)所觀察到的毒性作用進(jìn)行其它更大范圍的臨床生化檢查，以便進(jìn)行全面的毒性評價。 6.7.4 尿液檢查 一般不需要進(jìn)行，只有當(dāng)懷疑存在或觀察到相關(guān)毒性作用時才進(jìn)行尿液檢查。 6.8 病理檢查 6.8.1 大體解剖 所有動物均應(yīng)進(jìn)行全面的大體解剖，內(nèi)容包括動物的外觀、體腔開口處、胸腔、腹腔等。肝、腎、腎上腺和睪丸等器官應(yīng)在分離后盡快稱重以防水分丟失。應(yīng)將主要組織器官保存在固定液中，以備日后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。 6.8.2 臟器稱重 心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸的重量和相對重量（臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%）為必測指標(biāo)，必要時加測其它臟器重量和臟器系數(shù)。 6.8.3 病理組織學(xué)檢查 通常至少應(yīng)包括心、肝、脾、腎、胃、大腦、肺、睪丸（卵巢）、附睪、腎上腺等。根據(jù)需要，還可包括腦橋、小腦和大腦皮層、腦垂體、主動脈、氣管、胰、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、甲狀腺（包括甲狀旁腺）、胸腺、前列腺、子宮、乳腺、皮膚、肌肉、胸骨(包括骨髓)、淋巴結(jié)、眼球等。 如果毒性作用提示或作為被研究的靶器官時還可選擇檢查唾液腺、生殖附屬器官、皮膚、眼、股骨(包括關(guān)節(jié)面)、脊髓(包括頸部、胸部、腰部)、淚腺、雌性乳腺、大腿肌肉等。 要先對高劑量組和對照組動物及系統(tǒng)解剖時發(fā)現(xiàn)的異常組織作詳盡的組織學(xué)檢查，其他劑量組一般僅在高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時才進(jìn)行組織學(xué)檢查。在附加組，應(yīng)對那些在染毒組呈現(xiàn)毒性作用的組織和器官進(jìn)行檢查。 中、低劑量組動物也需做肺的病理組織學(xué)檢查，肺部感染情況可判斷動物的健康狀況。必要時肝、腎也做同樣的檢查。 6.9 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與評價 6.9.1 結(jié)果的處理 可通過表格形式總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果，顯示試驗(yàn)開始時各組動物數(shù)、出現(xiàn)毒性反應(yīng)的動物數(shù)、毒性反應(yīng)的類型和動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的百分比。對所有數(shù)據(jù)應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行評價。 6.9.2 試驗(yàn)結(jié)果的評價 亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果，并考慮到毒性效應(yīng)指標(biāo)和解剖及病理組織學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合評價。毒性評價應(yīng)包括受試樣品染毒劑量是否出現(xiàn)毒性反應(yīng)、毒性反應(yīng)的發(fā)生率及其程度之間的關(guān)系。這些反應(yīng)包括行為或臨床異常、肉眼可見的損傷、靶器官、體重變化情況、死亡效應(yīng)以及其它一般或特殊的毒性作用。成功的亞慢性試驗(yàn)應(yīng)能夠提出統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的無可見有害作用水平（NOAEL）。 7 鑒定報(bào)告 除一般鑒定報(bào)告的內(nèi)容外，還應(yīng)包括以下方面： 7.1 試驗(yàn)方法； 7.2 按性別和劑量的毒性反應(yīng)數(shù)據(jù)； 7.3 試驗(yàn)期內(nèi)動物死亡的數(shù)量和時間； 7.4 毒性作用或其它作用； 7.5 每種異常癥狀出現(xiàn)的時間及其轉(zhuǎn)歸情況； 7.6 動物體重資料、食物攝入量和/或飲水量資料； 7.7 眼科檢查結(jié)果 7.8 血液學(xué)檢查結(jié)果； 7.9 臨床生化檢查結(jié)果； 7.10 大體解剖所見； 7.11 病理組織學(xué)檢查所見的詳細(xì)描述； 7.12 對結(jié)果進(jìn)行處理的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法； 7.13 確定無可見有害作用水平（NOAEL）； 7.14 結(jié)論。 8 試驗(yàn)結(jié)果的解釋 亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)?zāi)軌蛱峁┦茉嚇悠吩诮?jīng)口反復(fù)接觸時的毒性作用資料。雖然其試驗(yàn)結(jié)果僅能有限地外推到人，但它可為確定人群暴露的無作用水平和允許暴露水平提供有價值的信息。 涉及地區(qū)：廣東省、浙江省、福建省、海南省、云南省、廣西省、貴州省、新疆省、四川省、重慶市、西藏省、湖南省、江西省、湖北省、上海市、北京市、天津市、安徽省、江蘇省、甘肅省、寧夏省、內(nèi)蒙古省、黑龍江省、吉林省、遼寧省、山東省、陜西省、山西省、河南省、河北省