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生物樣品掃描電鏡

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　　生物樣品掃描電鏡常規(guī)掃描電鏡對樣品要求:必須是干燥的，不含水分或揮發(fā)性物質;具有一定機械強度,能耐受電子束轟擊；具有導電性，被激發(fā)時能夠產生足夠的二次電子。生物材料特點:含水分多，質地柔軟，機械強度小;組成元素的原子序數低，導電性差,激發(fā)后二次電子的產額較少。制樣的任務:通過一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態(tài)，又要改良其物理性能，使其適合在電鏡下觀察成像。　　電鏡是進行材料表征時用到一種重要工具，幫助觀察材料的微觀形貌。然而，在觀察軟/濕生物材料時(離體組織，帶細胞材料等)，涉及到觀察樣品的固定、脫水、干燥、金屬濺射等步驟，處理復雜，耗時較長。　　冷凍的水凝膠觀察　　生物樣品掃描電鏡的構成：　　主要四大系統(tǒng)：電子光學系統(tǒng)、信號收集及顯示系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和電源系統(tǒng)。　?。?）電子光學體系：主要包括電子槍、電磁透鏡、掃描線圈和樣品室等部件。　　電磁透鏡：聚焦電子槍束斑，束斑越小，成像單元越小，分辨率越高。　　掃描線圈：使電子束偏轉，在樣品上做光柵狀掃描，激發(fā)多種電子信號。　　樣品室：放置樣品，并安裝有各種信號探測器。　　（2）信號收集及顯示系統(tǒng)：收集樣品在入射電子束作用下產生的各種信號，二次電子、背散射電子、特征X射線等，并進行放大轉換顯示在顯示系統(tǒng)上像。　?。?）真空系統(tǒng)：場發(fā)射電子顯微鏡的電子槍需要高真空度，所以配有2臺離子泵，1臺分子泵和一臺機械抽空泵。　?。?）電源系統(tǒng)：包括啟動的各種電源，檢測-放大系統(tǒng)，真空系統(tǒng)和成像系統(tǒng)等。　　分辨率的下降，掃描樣品在干燥過程中，由于失去水分會造成組織和細胞結構發(fā)生皺縮。此外，液體巨大的表面張力，將對細胞超微結構產生嚴重的影響。因此，生物樣品的干燥是掃描制備中的關鍵。樣品觀察表面必須具有良好的導電性和較高的二次電子發(fā)射率　　生物樣品掃描電鏡掃描圖像的質量與樣品受激發(fā)產生的二次電子的多少有很大的關系。對于一幅由10°個像素組成的圖像，生物樣品掃描電鏡掃描探針在樣品的每個掃描點上要產生平均6個二次電子，對于生物樣品，一般只能產生0.1~2個二次電子，使得圖像的質量與分辨率均受到影響。另一方面由于生物樣品的導電性較差，入射電子在樣品表面堆積，容易形成充放電現象，造成忽亮忽暗、全黑全白、圖像錯位等反常圖像。因此，提高樣品的導電性、消除充放電效應和增強二次電子發(fā)射率是生物樣品掃描制備的另一個基本要求。　　低真空下電鏡觀察葉子氣孔　　是在真空狀態(tài)下觀察樣品的表面形態(tài)。而生物樣品主要特點是含水量多，脫水干燥過程中容易收縮變形;大多數生物組織由碳、氫、氧、磷、鉀等原子序數較低的元素組成，不易激發(fā)二次電子，導電性較差。因此制備的樣品要求滿足以下條件。　　1．樣品觀察表面必須真實　　樣品觀察表面必須保持其在活休狀態(tài)時的形貌。在樣品處理中要去掉覆蓋在表面的灰塵、粘液、蠟質等雜質。此外，取樣時避免機械損傷。　　2．樣品必須干燥且不變形　　含水的生物樣品在真空條件下極易揮發(fā)，因此，在掃描觀察時樣品必須干燥，以防水分的蒸發(fā)影響儀器的真空度　　注意事項：　　1.細菌和真菌的處理方法與細胞一樣，但固定時間需延長（幾小時甚至過夜）；　　2.在樣品制備的過程中應始終保持樣品濕潤，切勿讓樣品干裂；　　3.由于掃描電鏡觀察樣品表面，因此一定要沖洗干凈樣品表面的殘余雜質；　　4.較大樣品需將樣品切成片狀，厚度不超過2-3mm。　　一、取樣：　　選取觀察材料需根據材料的特性與觀察目的的不同，采取不同的方法。取樣的基本要求:取材動作迅速;取材部位準確;固定及時;避免機械損傷。體積的大小沒有太大的限制，觀察表面的面積通常不超過10mm×10mm，厚度約兒個毫米。對于一些微小的單體材料（如游離細胞、細菌、線蟲等)，取樣時應注意材料數量要取夠，防止在制備過程中由于丟失造成材料不足而影響觀察。對于樣品斷裂面的獲取最好采用冷凍斷裂的方法。　　二、清洗：　　樣品的清洗主要有二個作用。其一是用清洗液除去樣品觀察表面的雜質或異物，其二是用緩沖液清洗掉沒有與樣品結合的固定劑。　　用清洗液清洗去除樣品表面的灰塵、粘液、油脂、蠟質等，可使樣品表面充分露。清洗液有雙蒸水、生理鹽水、含酶的清洗液、各種緩沖液、有機溶劑等。清洗的方法可采用氣吹、沖洗、刷洗、超聲波清洗等方法。清洗過程中要避免對樣品表面細微結構損傷。清洗的具體做法可根據研究l的、樣品性質和樣品對環(huán)境變化的敏感程度選用不同的清洗液和清洗方法。　　三、固定　　固定的目的是利用固定劑保存樣品細胞內的各種成分和結構，使它盡可能接近活體狀態(tài)。固定的方法的是戊二醛——餓酸雙固定，其中餓酸固定還具有增加組織的導電性的作用。對一些觀察倍數要求不是很高的材料，可只用戊二醛單固定。對一些形態(tài)結構不易發(fā)生變化的材料（如種子、某些花粉、孢子等)，甚至可以不用固定。固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌、菌絲之類的材料，可用餓酸蒸氣薰蒸加以固定。培養(yǎng)細菌的菌毛在取樣之前，可先加入戊二醛固定。　　固定劑的種類、配制方法、固定時間和操作條件及要求與透射電鏡樣品固定處理基木相同。　　四、脫水　　掃描電鏡樣品脫水的目的是用脫水劑取代樣品中的游離水，為了使樣品在干燥過程中，避免樣品中水分直接蒸發(fā)時產生巨大的表面張力(水的表面張力在20℃時達46000kg/cm3),使樣品結構遭到損傷。常用的脫水劑是乙醇和丙酮，采用等梯度系列脫水的方法，脫水時間間隔5~15分鐘。在100%脫水劑中要過2~3次。　　螨蟲自然風干電鏡直接觀察　　選擇電鏡　　1、如果需要研究樣品的內部結構,例如細胞器的改變,則應選擇透射電鏡觀察　　2、如果需要研究樣品表面的形態(tài)結構,如細胞的外形、細胞的生長形態(tài)等,則應選擇掃描電鏡觀察　　生物樣品取材、固定、保存　　1、透射電鏡樣品: 　　1) “快速"：指盡量在活體條件下取材或動物斷血后2分鐘內取材,并迅速將組織放入電鏡專用3.5%戊二醛固定液內(不可用酒精或消毒級戊二醛固定),并于4℃冰箱內保存,切忌樣品結冰。　　2) “準確"：指取材部位要準確。取材的器械要鋒利,盡量減少對組織的牽拉和擠壓。　　3) “體積小、低溫"：指組織厚度不應大于3mm,取材溫度最好控制在4℃左右進行操作。　　2、掃描電鏡樣品　　1) 取材時還應盡量保護觀察面,避免用鑷子夾持觀察區(qū)域,在固定前,通常應用適當的清洗液清洗樣品表面的雜質,灰塵,粘液等附著物。　　2) 常用的清洗波有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液或含酶的清洗液。　　3) 樣品取好后,放入3.5%戊二醛固定液內固定,保存在4℃冰箱中，切忌樣品結冰。　　流程　　1、透射電鏡　　取樣——3.5%戊二醛前固定；1%鐵酸后固定——酒精、丙酮逐級梯度脫水——Epon-618滲透、包理——半薄切片——光鏡選區(qū)定位——修塊——超薄切片機切片——檸檬酸鉛、醋酸鈾雙染色——透射電鏡觀察——攝片——分析+報告　　2、掃描電鏡樣品　　1) 取材——清洗——固定——冷凍——SEM觀察（冷凍電鏡）　　2) 取材——清洗——固定——脫水——干燥——鍍膜——SEM觀察（常規(guī)檢測）　　3) 取材——清洗——固定——組織導電處理——脫水——SEM觀察（特殊樣品，例如外泌體）生物樣品掃描電鏡http://www.yuxiubio.com/Products-33656721.html http://www.yuxiubio.com/

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