1 均相非放射性同位素法 上述這些非均相的方法，存在操作繁多的問題。隨著技術(shù)的發(fā)展，越來越多的均相非放射性方法開始被應(yīng)用于激酶活性的檢測之中，根據(jù)實驗原理的不同，可以分為檢測ATP的量、檢測ADP的量、檢測帶標(biāo)記或修飾的多肽底物、配體激酶結(jié)合法等。 1.1 檢測剩余的ATP的量 有些方法可以利用測定激酶反應(yīng)中未被消耗掉的ATP量來檢測酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo?技術(shù)。該方法利用激酶反應(yīng)后剩余的ATP，將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，并發(fā)出化學(xué)冷光，熒光信號值與激酶活性成反比。該試劑盒里的重組熱穩(wěn)定熒光素酶(Ultra-GloTM)，發(fā)出穩(wěn)定的“輝光”型熒光，半衰期大于5個小時，不需要配套進樣器的熒光儀，可成批處理大量的微孔板。Ultra-GloTM發(fā)出的穩(wěn)定熒光可適用于多種檢測條件，與特定的緩沖液組成相搭配，可減少來自化合物的自發(fā)熒光的干擾。 該檢測方法的成本很低，但為了產(chǎn)生大于2倍的信噪比，至少需要50%的轉(zhuǎn)化率，因此不能用于進行激酶性質(zhì)的研究，但在ATP產(chǎn)生50%~80%轉(zhuǎn)化率的時候，抑制劑的活性的偏移在2到3倍之間，處于可以接受的范圍，因此該方法可適用于抑制劑的高通量篩選。 1.2 檢測ADP的生成量 該類方法較易檢測一些非多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同時也可以測定一些ATP酶的活性。該類方法又可以分為ADP偶聯(lián)反應(yīng)，即將ADP轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)并進行檢測，例如Promega的ADPGloTM；依靠ADP抗體檢測的方法，例如Invitrogen的Adapta?，Cisbio的Transcreener?等方法； 1.2.1 ADP-GloTM ADP-Glo?(原理見圖1)是Promega公司開發(fā)的一種發(fā)光法激酶檢測方式，檢測激酶反應(yīng)中所形成的ADP的量來反應(yīng)激酶活性。在該檢測方法中，激酶反應(yīng)中剩余的ATP會首先被ADP-Glo試劑消耗掉；接下來，激酶反應(yīng)中生成的ADP則會被激酶檢測試劑還原成ATP；然后，ATP在Ultra-Glo?螢光素酶的作用下，與熒光素反應(yīng)發(fā)光，發(fā)光信號與激酶活性正相關(guān)。ADP-Glo?可用于檢測幾乎任何可生成ADP的酶的活性，不需要抗體參與以及放射性標(biāo)記。這種檢測方法相當(dāng)敏感，能夠檢測到的ADP的濃度下限為20 nM。Liu等利用ADP-GloTM技術(shù)篩選得到了CK2的抑制劑香豆雌酚，并分析了抑制劑的機制。 1.2.2 其他檢測ADP生成量的方法 除了Promega公司的ADP-GloTM以外，很多其他公司也開發(fā)了類似檢測方法，譬如DiscoveRx公司的ADP Hunter?、Cisbio公司的Transcreener?以及Life technologies公司的Adapta?。其中ADP Hunter?可以利用激酶反應(yīng)中產(chǎn)生的ADP，將phosphoenolpyruvate, PEP轉(zhuǎn)化為pyruvate，并最終轉(zhuǎn)化為熒光信號。該方法可以實時監(jiān)測激酶的活性變化。而Transcreener?和Adapta?則是在ADP的特異性單克隆抗體上標(biāo)記銪(Eu)原子，同時再使用d2或者AlexaFluour647等熒光分子標(biāo)記的ADP來競爭激酶反應(yīng)的產(chǎn)物ADP，用于檢測ADP的生成量。 1.2.3 檢測ADP生成量的方法的優(yōu)缺點 這些檢測ADP的方法，其優(yōu)點在于：(1)檢測產(chǎn)物而非底物，因此靈敏度要遠遠高于檢測ATP消耗量的Kinase-Glo?；(2)不僅可以應(yīng)用于蛋白激酶的活性檢測，同時糖激酶、脂激酶、ATP酶也可以使用此類方法進行活性測定；(3)由于很多激酶本身有內(nèi)在ATP酶的活性，因此在反應(yīng)體系中可以考慮不使用多肽底物，從而降低成本。當(dāng)然，這些方法也有一些相對不足之處，如易受到ATP酶活性的干擾，不能測定活細胞內(nèi)激酶的活性等。 1.3 檢測帶標(biāo)記或者修飾的多肽產(chǎn)物 雖然上述方法可以檢測激酶活性，但更多的公司選擇對多肽底物進行各種修飾，并應(yīng)用熒光技術(shù)進行檢測，如熒光偏振(Fluorescence Polarization, FP)、熒光共軛能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)、時間分辨熒光(Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET)等方法。 1.3.1 熒光偏振(Fluorescence Polarization, FP) 熒光偏振技術(shù)是一種監(jiān)測分子轉(zhuǎn)動的技術(shù)，其原理是物質(zhì)分子量的大小決定了該物質(zhì)的運動和轉(zhuǎn)動速度，質(zhì)量越大，則轉(zhuǎn)動速度和角度越小，當(dāng)使用偏振光進行激發(fā)時，所獲得的偏振光的角度也有所不同。熒光偏振的定義公式為P=(III - I⊥)/(III + I⊥)。其中III表示發(fā)射光和激發(fā)光平行時的熒光強度，而I⊥則表示發(fā)射光和激發(fā)光垂直時的熒光強度。熒光偏振不依賴于激發(fā)光的強度或者熒光素的濃度。當(dāng)熒光素自由旋轉(zhuǎn)時，其偏轉(zhuǎn)角度是一個很小的數(shù)字，我們稱之謂低熒光偏振；而當(dāng)熒光素和其他大分子結(jié)合后，其偏轉(zhuǎn)角度增大，我們稱之謂高熒光偏振。 很多公司開發(fā)了相應(yīng)的試劑盒，包括Bell-Brook公司的Transcreener ? FP，DiscoveRx公司的HitHunter?，Millipore公司的KinEASE? FP，以及Molecular Devices公司的IMAP? FP等等。熒光偏振的優(yōu)點在于成本較低，均相的反應(yīng)較易應(yīng)用于高通量篩選；然而，由于很多因素會導(dǎo)致熒光分子轉(zhuǎn)動速度的變化，因此有一些假陽性和假陰性的結(jié)果無法避免。 1.3.2 熒光共軛能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 熒光共軛能量轉(zhuǎn)移是一種能實現(xiàn)完全自動化激酶活性檢測方法。該方法將“受體”熒光分子和“供體”熒光分子連接在一起，當(dāng)“供體”熒光分子受到激發(fā)時，能將非放射性的能量轉(zhuǎn)移到“受體”熒光分子上，并發(fā)生熒光信號。市場上的相關(guān)產(chǎn)品眾多，譬如Life Technologies公司的Z’-LYTE?以及PerkinElmer公司的AlphaScreen?等。 以Z’-LYTETM方法為例，其原理是磷酸化對多肽底物的保護作用(原理見圖2)。首先，在多肽底物的N端以及C端，分別標(biāo)記上“供體”熒光分子香豆素和“受體”熒光分子熒光素，這兩種熒光分子的發(fā)射光譜分別為445 nm和520 nm。如果多肽底物在激酶反應(yīng)中被磷酸化，就不容易受到蛋白水解酶的水解，F(xiàn)RET依然存在；相反，若激酶反應(yīng)體系的多肽底物沒有被磷酸化,未磷酸化的多肽底物會被蛋白水解酶降解，F(xiàn)RET不復(fù)存在。我們可以使用445 nm和520 nm的熒光強度的比率高低(S445/S520)來表示其磷酸化程度：比率越低，則多肽底物的磷酸化程度越高；反之，比率越高，則多肽底物的磷酸化程度越低。Deng等利用該方法得到抑制劑DC120對AKT的EC50值為153 nM。Z-LYTETM檢測方法的優(yōu)點是：(1)信噪比高，讀數(shù)穩(wěn)定，操作簡單，便于高通量化；(2)無需抗體，試劑價格相對便宜。但此類方法也有明顯的缺點：(1)容易受到蛋白水解酶的影響，無法測定多肽底物的一些相關(guān)參數(shù)，如多肽的 Km值，也不能進行一些較為復(fù)雜的抑制劑機制實驗；(2)如果化合物本身有很強的自發(fā)熒光，尤其在高濃度(如10 μM)時，會對結(jié)果造成很大的影響，必須經(jīng)過熒光校正；(3)如果化合物有蛋白水解酶的抑制性，就會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。